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食品物种源性检测之一——牛肉制品的动物源性检测

作者:新景实验室
版权说明:本文系原创文章 转载请标注出处和本文链接

肉制食品掺假的情况主要是以低价肉替代高价肉,从而达到降低成本赚取差价的目的因此鸡、鸭等肉制品的掺假情况较少,而牛、羊、驴等肉制品的掺假现象较多,特别是驴肉和羊肉掺假情况尤为严重。实验室最近购买了几种肉制品,准备检测其中的掺假情况,接下来就让小新带大家看看情况到底怎么样吧。

 

一、 实验目的

对牛肉制品进行动物源性检测,判断其所含成分。

 

二、 实验材料

1. 肥牛卷杭州达泰食品有限公司)、动物组织DNA试剂盒(Simgen Cat.No.3101050)牛源性DNA荧光PCR检测试剂盒(Simgen Cat.No.7801050)鸡源性DNA荧光PCR检测试剂盒(Simgen Cat.No.7805050)猪源性DNA荧光PCR检测试剂盒(Simgen Cat.No.7804050)鸭源性DNA荧光PCR检测试剂盒(Simgen Cat.No.7806050)1.5 ml离心管若干,一次性手术刀

2. 台式小量离心机eppendorf Centrifuge 5415D

旋涡振荡器(杭州米欧仪器有限公司XH-C)

电子恒温不锈钢水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂)

超微量分光光度计(Simgen Cat.No.Sim-100

超微量电子天平(福州华科电子仪器有限公司 TP-213

电泳仪(北京六一仪器厂 DYY-6C型)

ABI PRISM®7500荧光PCR

三、 实验方法

(一)DNA提取方法

1. 用手术刀切取25 mg肥牛卷再用刀尖将组织剁成匀浆状,转移组织到一个1.5 ml离心管中。

2. 加入20 μl蛋白酶K贮存液,再加入180 μl 56 ℃预热的Buffer AT,旋涡振荡数秒使组织匀浆分散开来。

3. 56℃水浴30分钟,期间旋涡振荡数次帮助组织溶解。

4. 加入200 μl Buffer SL,旋涡振荡约15秒混匀。将离心管置于70 ℃水浴10分钟。

5. 加入200 μl无水乙醇,旋涡振荡约15秒混合均匀。

6. 吸取步骤5中的溶液加入到核酸纯化柱(纯化柱置于2 ml离心管中)中,盖上管盖,12000 rpm离心30秒。

7. 2 ml离心管中的滤液,将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中,在核酸纯化柱中加入500 μl Buffer WA(加入无水乙醇), 盖上管盖,12000 rpm离心30秒。

8. 2 ml离心管中的滤液,将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中,在核酸纯化柱中加入600 μl Buffer WB(加入无水乙醇), 盖上管盖,12000 rpm离心30秒。

9. 2 ml离心管中的滤液,将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中,13200 rpm离心2分钟。

10. 2 ml离心管,将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中,在纯化柱中加入100 μl 56 ℃温育的Buffer TE,盖上管盖,室温静置1分钟,12000 rpm离心30秒得到DNA

 (二)荧光PCR操作方法

1. 按照下表配置荧光PCR反应体系:


5管的用量配置好PCR反应混合液,按每管35 μl的量将反应混合液分装到八联管中。

2. 10 μl提取的DNA,加入90 μl ddH2O混合均匀,将其稀释10倍作为DNA模板。

3. 依次在PCR反应混合液中平行加入4.2 μlDNA模板、ddH2O(阴性对照)、阳性对照(牛DNA、猪DNA、鸡DNA、鸭DNA),盖上管盖,简短离心,最后于ABI PRISM®7500荧光PCR仪中进行荧光定量PCR。实验参数如下:(95℃ 1 min;95℃ 10s60℃ 30s×40 cycles

四、 实验结果

微量分光光度计上用Buffer TE调零,测量洗脱下来的DNA,结果如下:



2.1%的琼脂糖凝胶上,加入5 μl提取到的DNA,电泳20分钟,结果如下:

3.荧光PCR扩增结果如下:


五、 讨论与分析

1. 超微量分光光度计测量结果可知,从肥牛卷中成功提取到了一定量的DNA,其中A260/280比值偏高,考虑到肥牛卷是加工产品,RNA还存在的可能性极低,推测是降解的DNA。结合电泳图可知,提取的DNA确实存在严重的拖尾情况,不过主条带清晰明显,不影响后续的PCR扩增。

2. 由荧光PCR检测结果可知,此款肥牛卷中除了检测到源性成分外,还检测到了源性成分、鸡源性成分和源性成分。但是源性成分、鸡源性成分和源性成分CT值分别为:32.91532.99734.82335.01334.92334.891,相比牛源性成分检测到的数字要大13-14CT值,推算下来浓度差距达到将近一万倍,掺假从动机上分析可能性不成立。

3. 由于CT值接近35被称为临界阳性值(即只有几个DNA分子检测到的CT值),所以我们推测这些非牛源的DNA来源最大的可能性是肉类加工过程中的检疫、运输、包装等流程所掺入的,杭州达泰食品有限公司提供的肥牛卷没有掺假行为。











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