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实测快速通用型基因组DNA提取试剂盒的性能

作者:新景实验室
版权说明:本文系原创文章 转载请标注出处和本文链接

实验样本类型多,提取DNA需要买好几种试剂盒?今天小新为有这方面烦恼的用户推荐一款新产品——快速通用型基因组DNA提取试剂盒,这款试剂盒能从容应对各类常见样本,让您做到一盒在手,各种DNA都有。接下来就让小新带大家看看这款试剂盒是不是真有这么好用。

 

一、 实验目的

测试快速通用型基因组DNA提取试剂盒对不同类型样本基因组DNA的提取效果。

 

二、 实验材料

枯草杆菌、猪肉、小蓬草、人的粪便、人的抗凝全血、1.5 ml离心管若干

快速通用型基因组DNA提取试剂盒(Simgen Cat.No.3302050

2×PCR MixSimgen Cat.No.7003100

1.3 kb β-球蛋白引物(FTTAGGCCTTAGCGGGCTTAGAC/RCCAGGATTTTTGATGGGACACG

细菌16s rDNA引物(27FAGAGTTTGATCMTGGCTCAG/1492RGGHTACCTTGTTACGACTT

植物GAPDH引物(FGCTCACTTGAAGGGTGG/RCCATTCGTTGTCGTACCA

溶菌酶(Simgen Cat. No. 8009500

研钵

旋涡振荡器(越新仪器,XH-C

台式小量离心机(eppendorf centrifuge 5415 D

电子恒温不锈钢水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂)

超微量分光光度计(Simgen Cat.No.sim100

电泳仪(北京六一仪器厂,DYY-6C型)

PCR仪(Techne FPROG5Y Progene Thermal

 

三、 实验步骤

(一)样本DNA提取

样本使用前处理:

【从动物组织中提取基因组DNA

1. 用手术刀切取50 mg猪肉组织,再用刀尖将组织剁成匀浆状,转入一个洁净的1.5 ml离心管中。

2. 加入150 μl Buffer TE300 μl Buffer GE,旋涡振荡30秒混合均匀。

3. 加入20 μl蛋白酶K贮存液,56℃水浴10分钟。

4. 加入500 μl Buffer PE,用力摇晃5~10次形成乳浊液,再旋涡振荡30秒混合均匀,最高速(≥12,000×g)离心1分钟。

【从植物组织中提取基因组DNA

1. 称取200 mg小蓬草植物组织,剪成小块放入研钵中,加入液氮,使组织冷冻完全后,快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮以防止组织融化,研磨充分后将研钵放入56℃水浴至样品粉末刚开始融化。加入300 μl Buffer TE,继续研磨30秒混匀。

2. 转移200 μl研磨好的匀浆至1.5 ml离心管中,如匀浆体积不足200 μl,补加Buffer TE200 μl

3. 加入300 μl Buffer GE20 μl蛋白酶K贮存液,立即旋涡振荡1分钟混合均匀。56℃水浴10分钟。

4. 加入500 μl Buffer PE,用力摇晃5~10次形成乳浊液,再旋涡振荡30秒混合均匀,最高速(≥12,000×g)离心5分钟。

【从培养细胞﹑淋巴细胞﹑全血或骨髓、骨头中提取基因组DNA

1.   收集200 μl全血于1.5 ml离心管。

2.   加入300 μl Buffer GE20 μl蛋白酶K贮存液。立即旋涡振荡30秒混合均匀。

3.   56℃水浴10分钟。

4.   加入500 μl Buffer PE,用力摇晃5~10次形成乳浊液,再旋涡振荡30秒混合均匀,最高

速(≥12,000×g)离心1分钟。

【从细菌中提取基因组DNA

1. 1.5 ml离心管收集5 ml细菌培养物,加入100 μl Buffer TE,旋涡振荡充分悬浮细菌。加入100 μl溶菌酶溶液,旋涡振荡约15秒混匀,37 ℃水浴30分钟。

2. 加入300 μl Buffer GE20 μl蛋白酶K贮存液。立即旋涡振荡30秒混合均匀。

3. 56℃水浴10分钟。

4. 加入500 μl Buffer PE,用力摇晃5~10次形成乳浊液,再旋涡振荡30秒混合均匀,最

高速(≥12,000×g)离心1分钟。

【从粪便中提取基因组DNA

1. 1.5 ml离心管收集50 mg粪便,加入150 μl Buffer TE,旋涡振荡直至粪便颗粒全部悬浮。

2. 加入300 μl Buffer GE20 μl蛋白酶K贮存液。立即旋涡振荡30秒混合均匀。

3. 56℃水浴10分钟。

4. 加入500 μl Buffer PE,用力摇晃5~10次形成乳浊液,再旋涡振荡30秒混合均匀,最高速(≥12,000×g)离心1分钟。

【后续相同的操作步骤】

5. 吸取所有上清液加入到核酸纯化柱中(核酸纯化柱置于2 ml离心管中),盖上管盖,12,000×g离心30秒。

6. 2 ml离心管中的滤液,将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中,在核酸纯化柱中加入800 μl Buffer WB,盖上管盖,12,000×g离心30秒。

7. 2 ml离心管中的滤液,将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中,在核酸纯化柱中加入300 μl Buffer WB,盖上管盖,最高速(≥12,000×g)离心1分钟。

8. 2 ml离心管,将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中,在纯化柱的膜中央加入100 μl 56℃温育的Buffer TE,盖上管盖,室温静置1分钟,12,000×g离心30秒。

9. 弃纯化柱,得到的DNA放于﹣20℃冰箱备用。

(二)PCR扩增

扩增体系:


扩增条件:

1. 全血DNA(人1.3 kb β-球蛋白引物)/粪便DNA(细菌16s rDNA引物):94℃,5 min{94℃,45sec55℃,45sec72℃,1min30sec}×30 cycles72℃,10min

2. 小蓬草DNA(植物GAPDH引物):96℃,3 min{94℃,30sec58℃,50sec72℃,1min}×35 cycles72℃,10min

四、 实验结果

1. 在超微量分光光度计上用Buffer TE调零,测量提取的DNA,结果如下:


2. 1%的琼脂糖凝胶上加入5 μl洗脱的基因组DNA/扩增产物/DNA Marker进行电泳,结果如下:



一、 分析与讨论

1. 由浓度测量结果和DNA电泳图可知,快速通用型基因组DNA提取试剂盒从五种不同类型的样本中都成功提取到了基因组DNA。这五类样本包括了动物、植物、细菌、粪便、血液这些常见的实验样本,证明了快速通用型基因组DNA提取试剂盒的强大通用性。

2. 快速通用型基因组DNA提取试剂盒在提取上述各种样本基因组DNA的过程中都没有额外进行RNase A的消化,但是将提取到的DNA电泳时却都没有观察到残留的RNA条带,甚至是最容易残留RNA的植物、细菌、粪便等样本。说明这个产品可以不用额外添加RNase A就能去除RNA

3. 快速通用型基因组DNA提取试剂盒采用了一项特殊的萃取技术,能使样本中被蛋白酶K消化后的各种残留物(包括未消化完全的样本碎片、蛋白、脂类物质、色素、多糖等)都萃取到下相中。也就是说在吸取上相过柱纯化这一操作步骤前,DNA已经提前进行了一次预纯化,这也就是为什么快速通用型基因组DNA提取试剂盒只需要一种洗液洗涤纯化柱的原因。后续扩增产物电泳结果中我们也可以发现,快速通用型基因组DNA提取试剂盒提取的DNA不影响后续的PCR扩增,即使是应对粪便、植物这类抑制物较多的样本也完全没有问题。

 

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